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從營養(yǎng)學角度來說,苯丙氨酸是人體內(nèi)不能自然合成,所以是必需的氨基酸之一。從化學性質來說,是一種有機化合物,屬于脂肪族氨基酸?;瘜W式為C9H11NO2,分子量為165.19,溶于水,難溶于甲醇,乙醇,乙醚。苯丙氨酸在生物體內(nèi),經(jīng)過苯丙氨酸羥化酶的作用,氧化生成酪氨酸。苯丙氨酸和酪氨酸一起合成神經(jīng)遞質和激素,參與機體內(nèi)的糖代謝和脂肪代謝。苯丙氨酸可以用于在醫(yī)藥,食品等領域。
檢測樣品中的苯丙氨酸含量,主要包括高效液相色譜(HPLC)法,紫外分光光度法(UV-Vis),酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法,薄層色譜法,電位滴定法等。
以HPLC為例,簡單的介紹一下測試流程和注意事項。
1.樣品處理
在生物實驗中,檢測氨基酸含量是相對普遍的。一般測17-20種氨基酸,通過對樣品的處理,可以準確的測出含量?,F(xiàn)在的方法,相對比較成熟。比如采用水解和衍生的方法,獲得清晰的色譜圖。
水解:用0.2g樣品,加入2ml的6mol/L的HCL,振蕩5min。之后,放入105℃的烘箱中水解24h,拿出來放到室溫,HCL少的話補充點。這個時候,就要用6mol/LNAOH滴定到中性,用水定容到5mL,繼續(xù)振蕩5min。完成這個步驟后,用4000r/min離心10min,取上清液。
衍生:將水解后的上清液,吸取0.5ml,放到棕色離心管中,加入pH=9.0的NaHCO3溶液和DNFB各0.5ml,放入60±0.5℃水浴中,避光反應60min。取出立即用冷水冷卻至室溫,加入3.5ml pH=7.0磷酸緩沖溶液,充分混勻,室溫避光反應15min,取上清液過0.22μm 濾膜,待液相色譜測定。
2.色譜條件
C18色譜柱:250*4.6mm,5μm,柱溫38℃; 流動相:A:乙腈:甲醇=90:10 B:0.02mol/LNaH2PO4+Na2HPO4,1ml/min,梯度洗脫,DAD檢測器,波長360nm;進樣量20uL。
3.標準曲線
將標品稀釋6個點的濃度,測出來各個點的色譜峰。對色譜峰面積進行積分,結合對應的濃度,繪制出標準曲線,得到回歸方程。相關系數(shù)r2需要大于0.999,有的地方需要回收率,重復性,精密度等。
4.含量計算
根據(jù)樣品測定出來的色譜峰面積,代入到回歸方程中,計算出樣品中的苯丙氨酸含量。