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α-酮戊二酸,化學(xué)式為C5H6O5,分子量為146。它廣泛的存在自然界中,比如菠菜中就有豐富的α-酮戊二酸。α-酮戊二酸是谷氨酸、谷氨酰胺和精氨酸的前體物質(zhì),通過細(xì)胞代謝過程產(chǎn)生。也可以通過生物合成的方法,具有促進(jìn)能量代謝,增強(qiáng)抗氧化能力,保護(hù)骨骼健康,提高免疫力,保護(hù)神經(jīng)等作用。α-酮戊二酸是三羧酸循環(huán)的中間代謝產(chǎn)物,是谷氨酸、谷氨酰胺和精氨酸的前體物質(zhì),參與維生素和有機(jī)酸的合成和代謝。
檢測樣品中α-酮戊二酸的方法,有高效液相色譜(HPLC)法,有比色法,也有酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法。比色法和ELISA法是可以通過試劑盒的形式,按照說明書的要求,按部就班完成操作,注意一下試劑和操作的問題。這里以HPLC為例,簡單的介紹一下檢測過程。
1.α-酮戊二酸的提取過程
將樣品研磨粉碎,過篩,準(zhǔn)確稱取1g,放入50ml的容量瓶中,加入45ml的乙酸乙酯,超聲處理30min,靜置過夜。過夜后,加入乙酸乙酯定容,過濾后,吸取25ml濾液蒸干,加入甲酸溶解,定容到10mL,待測。
2.色譜條件
C18的色譜柱,250mm長,4.6mm內(nèi)徑,5um粒徑,柱溫30℃;以磷酸二氫鈉溶液(pH3.3-3.5)和水為流動(dòng)相,等度洗脫,流速1ml/min,進(jìn)樣量10-20ul,紫外檢測器,波長205nm,僅供參考。在實(shí)際情況下,需要對(duì)條件進(jìn)行驗(yàn)證或重新開發(fā),充分優(yōu)化色譜條件。這個(gè)過程,考驗(yàn)的是實(shí)驗(yàn)人員對(duì)機(jī)器設(shè)備性能參數(shù)的熟悉,對(duì)樣品及目標(biāo)化合物的物理和化學(xué)性質(zhì)的了解。
3.標(biāo)準(zhǔn)曲線
首先,就要對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品用流動(dòng)相或理想的有機(jī)溶劑進(jìn)行配制。一般情況下,為了更準(zhǔn)確起見,采用外標(biāo)法。也就是標(biāo)準(zhǔn)曲線,梯度稀釋6個(gè)點(diǎn),在檢測器的有效檢測范圍內(nèi)。進(jìn)樣到HPLC,測出來色譜峰,對(duì)面積進(jìn)行積分。對(duì)應(yīng)6個(gè)不同的濃度,在表格中用函數(shù)來繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到回歸方程,r2需要大于0.999。有的時(shí)候,還需要驗(yàn)證回收率,重復(fù)性,精密度等。樣品中的α-酮戊二酸含量,就是根據(jù)樣品的色譜峰面積,和回歸方程,計(jì)算出來的。